Archive for 2013
Buffer Biotek
By : Pratama Putra
Buffer A1
Fungsi: untuk meresuspensi pelet sel bakteri setelah pemanenan menggunakan sentrifus. EDTA sebagai kelator mengikat ion Mg2+ untuk inaktivasi enzim DNAse; glukosa untuk menyamakan potensial osmotik sel selama proses lysis menggunakan SDS agar bakteri tidak pecah seketika.
· Buffer A2
Isi: NaOH dan SDS
Fungsi: melisiskan sel dengan cara melarutkan membran sel (oleh SDS) dan mendenaturasi DNA kromosomal, namun tidak mendenaturasi DNA plasmid. DNA plasmid tidak terdenaturasi karena sifatnya covalently closed circular.
· Buffer A3
Isi: Kalium asetat, asam asetat glasial, aquadest.
Fungsi: menetralisir pH, ,emghentikam denaturasiDNA kromosomal sehingga terbentuk presipitat DNA kromosom yang menempel dan memisahlan DNA plasmid yang larut dalam supernatan.
Buffer A4
ditambahkan jika isolasi DNA dilakukan dengan kolom (silica). Fungsinya adalah untuk menghilangkan pengotor lain dalam supernatan. plasmid menempel pada silica
Buffer AE
untuk mengelusi, mengambil/melepas DNA yang menempel pada silica.
· Enzim RNAse
Digunakan untuk mendegradasi RNA sehingga plasmid hanya mengandung DNA.
· Loading Buffer
Digunakan untuk meningkatkan densitas sampel sehingga fragmen berada di dasar sumuran dan tidak menyebar.
· Akrilamid
Dapat membentuk rantai polimer panjang yang disebut poliakrilamid. Polimer ini dipakai sebagai pengental karena akan membentuk gel bila tercampur air.
· SDS
Untuk memutus ikatan disulfida protein agar menjadi unfolding dan menyelubungi protein dengan muatan negatif. Selain itu, SDS akan menghilangkan perbedaan muatan dan perbedaan konformasi di antara protein-protein tersebut, dengan cara memberi muatan negatif.
· TEMED
Sebagai katalisator pembentukan radikal bebas dari ammonium persulfat dan sebagai pemadat sehingga pencampurannya dilakukan terakhir agar larutan tidak menjadi padat terlebih dahulu sebelum seluruh bahan tercampur.
· APS
Sebagai katalisator dalam polimerisasi gel poliakrilamid
Umumnya, polimerisasi diawali dengan penambahan ammonium persulfat (APS) sebagai inisiator, dan tetrametilendiamin (TEMED) sebagai akselerator. Pada proses ini TEMED mempercepat pemecahan molekul APS menjadi sulfat radikal bebas, yang selanjutnya akan mengawali reaksi polimerisasi akrilamid dan bisakrilamid.
Tanpa adanya bisakrilamid akan terbentuk rantai polimerisasi akrilamid yang panjang, yang menghasilkan larutan kental namun bukan gel. Dengan penambahan bisakrilamid, pada rantai akrilamid tersebut akan terbentuk ikatan lintas silang (cross-link) pada interval tertentu sehingga terbentuk suatu jaringan dengan besar pori tertentu. Konsentrasi akrilamid menentukan ukuran pori-pori gel yang terbentuk sehingga ukuran pori dapat diatur dengan mengatur konsentrasi akrilamid. Makin rendah konsentrasi akrilamid yang digunakan, makin besar ukuran pori-pori gel, namun gel menjadi lunak dan mudah patah.